| 出品公司: | 生物风 |
|---|---|
| 感受态细胞名称: | NMY51 Ultracompetent cells；NMY51 |
| 菌种类型: | E.coli |
| 产品规格: | 10X100 微升 |
| 转化效率: | 大于1X10的9次方 |
| 基因型: | MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4 |
| 抗性: | 无抗性 |
| 质粒转化条件: | 42 ℃热激 |
| 生长条件: | 37 ℃, 有氧 |
| 用途: | 非毒性蛋白表达。 |
| 储存条件: | -80 ℃或者更低温度保存，避免反复冻融。 |
感受态细胞特点和简介
DUAL membrane系统是DUAL systems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术，它利用分离的泛素系统 (split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株Transformation marker为：trp1，leu2-3，报告基因为：HIS3，ADE2和 lacZ，第一步通过营养缺陷型报告基因 (HIS3，ADE2)进行选择性生长筛选，进一步通过 LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。原理：泛素 (ubiquitin)分子量很小，由 76 aa残基组成；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的 N端，然后被泛素专一性蛋白酶 (UBPs)识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分：N端 (Nub)，C端 (Cub)。首先，人为地将泛素 Nub的 3位异亮氨酸突变为甘氨酸 (NubI 突变为 NubG)。这样与 Cub的亲合力大大降低，避免了 Cub和 Nub自我结合或接近的可能性。其次，将Cub部分与人工合成的 LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合，UBPs也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成 bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白 (prey-NubG)。如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 NubG和 Cub的相互接近，被 UBPs识别，导致 LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。 此系统可使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志均为LEU；三种Prey质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为TRP。NMY51感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。
感受态细胞制备方法
生物风在氯化钙感受态细胞制作方法的基础上进行了改良，采用最新的二价锰法感受态细胞制备方法，制备得到NMY51超级感受态细胞（Ultracompetent cell）。转化效率是常规氯化钙制备法的10倍。
感受态细胞操作方法
1. 取NMY51感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。
注意：一次转化NMY51感受态细胞的建议用量为 50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl NMY51感受态细胞为例。
2. 向NMY51感受态细胞悬液中加入目的 DNA (100μl 的感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），轻弹混匀，在冰浴中静置30 分钟。
3. 将离心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒，然后快速将管转移到冰浴中，使NMY51感受态细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管。
注意：此步骤也可将离心管置于室温进行，时间不需十分准确，夏季或室温较高时，可放置5-8分钟左右；如果室温较低，可延长时间至8-15分钟左右。条件允许建议使用 42 ℃ 热激方法。
4. 向每个离心管中加入900 μl无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37 ℃摇床振荡培养45 分钟（150 rpm），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5. 将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的NMY51感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或者LB 固体琼脂培养基平板上，用无菌的弯头玻棒涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被完全吸收后，倒置平板，37 ℃培养12-16 小时。
注意：涂布用量可根据具体实验来调整。如转化质粒总量较多，可取更少转化产物涂布平板；反之，如转化的质粒总量较少，可取200-300 μl转化产物涂布平板；对于连接产物的转化菌液，可以通过离心（4000 rpm，2分钟）后倒掉大部分培养液上清，吹打悬浮菌体后，将其涂布于一个平板中。
6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新的培养平板。
感受态细胞注意事项
1. NMY51感受态细胞应保存在-70 ℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2. 进行转化操作时，应根据相应的温度及无菌条件的要求进行。
3. 为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。
4. 用于转化的连接产物或质粒的体积不能超过感受态细胞体积的15%.
5. 质粒超过7.5 kb后，随尺寸的增加转化效率会下降，质粒的尺寸超过10 kb时，在大肠杆菌增殖过程中也可能会出现质粒缺失现象；
6. 用于转化的质粒量在0.1 pg~50 ng间的效果最好，超过50 ng质粒时，平板上单克隆数目会增加，但是转化效率会下降。
7. 42 ℃热击时间与离心管的厚度、菌液的体积、转入片段的大小直接相关，一般建议热击60-90秒，热击时间不宜超过90秒，否则转化效率会下降很快；
