| 出品公司: | 生物风 |
|---|---|
| 感受态细胞名称: | Y2HGold Ultracompetent cells；Y2HGold |
| 菌种类型: | E.coli |
| 产品规格: | 10X100 微升 |
| 转化效率: | 大于1X10的9次方 |
| 基因型: | MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3, GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1 |
| 抗性: | 无抗性 |
| 质粒转化条件: | 42 ℃热激 |
| 生长条件: | 37 ℃, 有氧 |
| 用途: | 非毒性蛋白表达。 |
| 储存条件: | -80 ℃或者更低温度保存，避免反复冻融。 |
感受态细胞特点和简介
Y2HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为：trp1，leu2，报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。Y2HGold-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD (来自酵母转录因子GAL4N端1~174位氨基酸)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白；质粒pGADT7 的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域 (DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸区段的转录激活域 (AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成 bait融合蛋白 (bait -BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y2HGold有四个报告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子 (G1，G2，M1)启动，这三种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。Y2HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。
感受态细胞制备方法
生物风在氯化钙感受态细胞制作方法的基础上进行了改良，采用最新的二价锰法感受态细胞制备方法，制备得到Y2HGold超级感受态细胞（Ultracompetent cell）。转化效率是常规氯化钙制备法的10倍。
感受态细胞操作方法
1. 取Y2HGold感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。
注意：一次转化Y2HGold感受态细胞的建议用量为 50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl Y2HGold感受态细胞为例。
2. 向Y2HGold感受态细胞悬液中加入目的 DNA (100μl 的感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），轻弹混匀，在冰浴中静置30 分钟。
3. 将离心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒，然后快速将管转移到冰浴中，使Y2HGold感受态细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管。
注意：此步骤也可将离心管置于室温进行，时间不需十分准确，夏季或室温较高时，可放置5-8分钟左右；如果室温较低，可延长时间至8-15分钟左右。条件允许建议使用 42 ℃ 热激方法。
4. 向每个离心管中加入900 μl无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37 ℃摇床振荡培养45 分钟（150 rpm），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5. 将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的Y2HGold感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或者LB 固体琼脂培养基平板上，用无菌的弯头玻棒涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被完全吸收后，倒置平板，37 ℃培养12-16 小时。
注意：涂布用量可根据具体实验来调整。如转化质粒总量较多，可取更少转化产物涂布平板；反之，如转化的质粒总量较少，可取200-300 μl转化产物涂布平板；对于连接产物的转化菌液，可以通过离心（4000 rpm，2分钟）后倒掉大部分培养液上清，吹打悬浮菌体后，将其涂布于一个平板中。
6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新的培养平板。
感受态细胞注意事项
1. Y2HGold感受态细胞应保存在-70 ℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2. 进行转化操作时，应根据相应的温度及无菌条件的要求进行。
3. 为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。
4. 用于转化的连接产物或质粒的体积不能超过感受态细胞体积的15%.
5. 质粒超过7.5 kb后，随尺寸的增加转化效率会下降，质粒的尺寸超过10 kb时，在大肠杆菌增殖过程中也可能会出现质粒缺失现象；
6. 用于转化的质粒量在0.1 pg~50 ng间的效果最好，超过50 ng质粒时，平板上单克隆数目会增加，但是转化效率会下降。
7. 42 ℃热击时间与离心管的厚度、菌液的体积、转入片段的大小直接相关，一般建议热击60-90秒，热击时间不宜超过90秒，否则转化效率会下降很快；
